细胞凋亡与坏死是两种完全差别的细胞凋亡形式 ，，，，，凭证殒命细胞在形态学、生物化学和分子生物学上的差别 ，，，，，可以将二者区别开来。。。。。。细胞凋亡的检测要领有许多 ，，，，，下面先容几种常用的测定要领。。。。。。
一、细胞凋亡的形态学检测
凭证凋亡细胞固有的形态特征 ，，，，，人们已经设计了许多差别的细胞凋亡形态学检测要领。。。。。。
1、光学显微镜和倒置显微镜
（1） 未染色细胞：凋亡细胞的体积变小、变形 ，，，，，细胞膜完整但泛起发泡征象 ，，，，，细胞凋亡晚期可见凋亡小体。。。。。。贴壁细胞泛起皱缩、变圆、脱落。。。。。。
（2） 染色细胞：常用姬姆萨染色、瑞氏染色等。。。。。。凋亡细胞的染色质浓缩、边沿化 ，，，，，核膜裂解、染色质支解成块状和凋亡小体等典范的凋亡形态。。。。。。
2、荧鲜明微镜和共聚焦激光扫描显微镜
一样平常以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡的希望情形。。。。。。
常用的DNA特异性染料有：HO 33342 (Hoechst 33342) ，，，，，HO 33258 (Hoechst 33258),DAPI。。。。。。三种染料与 DNA的连系是非嵌入式的 ，，，，，主要连系在DNA的A-T碱基区。。。。。。紫外光引发时发射明亮的蓝色荧光。。。。。。
Hoechst是与DNA特异连系的活性染料 ，，，，，贮存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度 ，，，，，使用时用PBS稀释成终浓度为2~5mg/ml。。。。。。
DAPI为半通透性 ，，，，，用于通例牢靠细胞的染色。。。。。。贮存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度 ，，，，，使用终浓度一样平常为0.5 ~1mg/ml。。。。。。
效果评判：细胞凋亡历程中细胞核染色质的形态学改变分为三期：Ⅰ期的细胞核呈波纹状（rippled）或呈折缝样（creased） ，，，，，部分染色质泛起浓缩状态；；；；；；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边沿化；；；；；；Ⅱb期的细胞核裂解为碎块 ，，，，，爆发凋亡小体(图1)。。。。。。
3、透射电子显微镜视察
效果评判：凋亡细胞体积变小 ，，，，，细胞质浓缩。。。。。。凋亡Ⅰ期（pro-apoptosis nuclei）的细胞核内染色质高度盘绕 ，，，，，泛起许多称为气穴征象（cavitations）的空泡结构(图2)；；；；；；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边沿化；；；；；；细胞凋亡的晚期 ，，，，，细胞核裂解为碎块 ，，，，，爆发凋亡小体。。。。。。
图2
二、磷脂酰丝氨酸外翻剖析（Annexin V法）
磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine,PS）正常位于细胞膜的内侧 ，，，，，但在细胞凋亡的早期 ，，，，，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的外貌 ，，，，，袒露在细胞外情形中(图3)。。。。。。Annexin-V是一种分子量为35~36KD的Ca2+依赖性磷脂连系卵白 ，，，，，能与PS高亲和力特异性连系。。。。。。将Annexin-V举行荧光素（FITC、PE）或biotin标记 ，，，，，以标记了的Annexin-V作为荧光探针 ，，，，，使用流式细胞仪或荧鲜明微镜可检测细胞凋亡的爆发。。。。。。
碘化丙啶(propidineiodide,PI)是一种核酸染料 ，，，，，它不可透过完整的细胞膜 ，，，，，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞 ，，，，，PI能够透详尽胞膜而使细胞核红染。。。。。。因此将Annexin-V与PI匹配使用 ，，，，，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区脱离来。。。。。。
图3
要领
1、悬浮细胞的染色：将正常作育和诱导凋亡的悬浮细胞（0.5~1×106）用PBS洗2次 ，，，，，加入100ul Binding Buffer和FITC标记的Annexin-V（20ug/ml）10ul ，，，，，室温避光30min ，，，，，再加入PI（50ug/ml）5ul ，，，，，避光反应5min后 ，，，，，加入400ul Binding Buffer ，，，，，连忙用FACScan举行流式细胞术定量检测（一样平常不凌驾1h） ，，，，， 同时以不加AnnexinV-FITC及PI的一管作为阴性比照。。。。。。
2、贴壁作育的细胞染色：先用0.25%的胰酶消化 ，，，，，洗涤、染色和剖析同悬浮细胞。。。。。。
3、爬片细胞染色：同上 ，，，，，最后用荧鲜明微镜和共聚焦激光扫描显微镜举行视察。。。。。。
效果：
注重事项
1. 整个操作行动要只管轻柔 ，，，，，勿用力奏乐细胞。。。。。。
2. 操作时注重避光 ，，，，，反应完毕后尽快在一小时内检测。。。。。。
三、线粒体膜势能的检测
线粒体在细胞凋亡的历程中起着枢纽作用 ，，，，，多种细胞凋亡刺激因子均可诱导差别的细胞爆发凋亡 ，，，，，而线粒体跨膜电位的下降 ，，，，，被以为是细胞凋亡级联反应历程中最早爆发的事务 ，，，，，它爆发在细胞核凋亡特征（染色质浓缩、DNA断裂）泛起之前 ，，，，，一旦线粒体DYmt瓦解 ，，，，，则细胞凋亡不可逆转。。。。。。
线粒体跨膜电位的保存 ，，，，，使一些亲脂性阳离子荧光染料如Rhodamine 123、3 ，，，，，3-Dihexyloxacarbocyanine iodide[DiOC6（3）]、Tetrechloro-tetraethylbenzimidazol carbocyanine iodide[JC-1]、Tetramethyl rhodamine methyl ester(TMRM)等可连系到线粒体基质 ，，，，，其荧光的增强或削弱说明线粒体内膜电负性的增高或降低。。。。。。
要领：将正常作育的细胞和诱导凋亡的细胞加入使用终浓度为Rhodamine 123（1mM）或终浓度为DiOC6（25nM） ，，，，，JC-1（1mM） ，，，，，TMRM（100nM） ，，，，，37°C平衡30min ，，，，，流式细胞计检测细胞的荧光强度。。。。。。
注重事项
1． 始终坚持平衡染液中pH值的一致性 ，，，，，由于pH值的转变将影响膜电位。。。。。。
2． 与染推测达平衡的细胞悬液中若是含有卵白 ，，，，，他们将与部分染料连系 ，，，，，降低染料的浓度 ，，，，，引起假去极化。。。。。。
四、DNA片断化检测
细胞凋亡时主要的生化特征是其染色质爆发浓缩,染色质DNA在核小体单位之间的毗连处断裂,形成50~300kbp长的DNA大片断,或180~200bp整数倍的寡核苷酸片断,在凝胶电泳上体现为梯形电泳图谱(DNAladder)。。。。。。细胞经处置惩罚后 ，，，，，接纳通例要领疏散提纯DNA ，，，，，举行琼脂糖凝胶和溴化乙啶染色 ，，，，，在凋亡细胞群中可视察到典范的DNAladder。。。。。。若是细胞量很少 ，，，，，还可在疏散提纯DNA后 ，，，，，用32P-ATP和脱氧核糖核苷酸最后转移酶（TdT）使DNA标记 ，，，，，然后举行电泳和放射自显影 ，，，，，视察凋亡细胞中DNA ladder的形成。。。。。。
1. 大分子染色体DNA片断的测定
细胞凋亡的早期,染色体断裂成为50~300kbp长的DNA大片断。。。。。。所有凌驾一定分子量巨细的双链DNA分子在琼脂糖凝胶中的迁徙速率相同。。。。。。线性DNA的双螺旋半径凌驾凝胶半径时 ，，，，，即抵达区分力的极限。。。。。。此时凝胶不再按分子量的巨细来筛分DNA ，，，，，DNA像通过弯管一样 ，，，，，以其一端指向电场一极而通过凝胶 ，，，，，这种迁徙模式称之为"爬行"。。。。。。因此 ，，，，，细胞凋亡早期爆发的50~300kbp长的DNA大片断不可用通俗的琼脂糖凝胶电泳来疏散。。。。。。通常接纳脉冲电泳手艺可圆满地解决这一问题。。。。。。这个要领是在凝胶上外加正交的交变脉冲电场。。。。。。每当电场偏向改变后 ，，，，，大的DNA分子便滞流在爬行管中 ，，，，，直至新的电场轴向重新定向后 ，，，，，才华继续向前移动。。。。。。DNA分子量越大 ，，，，，这种重排所需要的时间就越长。。。。。。当DNA分子变换偏向的时间小于电脉冲周期时 ，，，，，DNA就可以按其分子量巨细脱离。。。。。。
参考文献 Brown,D.G., Sun, X.M., and Cohen, G.M.(1993) Dexamethasone-induced apoptosis involves cleavage of DNA to large fragments prior to internucleosomal fragmentation. J. Biol.Chem. 268, 3037-3039
2． DNA Ladder 测定
要领：收获细胞（1X107）沉淀 ，，，，，细胞裂解液 ，，，，，13000rpm′5min,网络上清 ，，，，，1%SDS和RnaseA（5mg/ml）56°C ，，，，，2h ，，，，，卵白酶K（2.5mg/ml）37°C ，，，，，2h ，，，，，1/10体积3M醋酸钠和2.5倍体积的冷无水乙醇沉淀DNA ，，，，，4°C住宿 ，，，，，14000rpm′15min ，，，，，最后将沉淀消融在TE buffer中 ，，，，，加DNA Loading Buffer ，，，，，1.2%琼脂糖凝胶电泳 ，，，，，EB染色并照相 ，，，，，效果：
参考文献 Herrmannm M, Lorenz HM, Voll R et al. A Rapid and simple method for the isolation of apoptotic DNA fragments. Nucleic Acid Res. 1994; 22:5506-5507
3． 凋亡细胞DNA含量的流式细胞计剖析
要领：网络细胞 ，，，，，70%冷乙醇（in PBS）4°C牢靠住宿 ，，，，，PBS洗涤 ，，，，，1000rpm′10min RNase A（0.5mg/ml）37°C消化30min PI（50mg/ml）染色 ，，，，，室温避光15min ，，，，，流式细胞仪剖析DNA亚二倍体的形成及细胞周期的转变。。。。。。
效果：
4. ApoAlertTM LM-PCR Ladder Assay (CLONTECH)
优点：敏感度高 ，，，，，适合于检测少量样本 ，，，，，小部分凋亡细胞。。。。。。如临床活组织检测。。。。。。
五、TUNEL法
细胞凋亡中,染色体DNA双链断裂或单链断裂而爆发大宗的粘性3'-OH最后 ，，，，，可在脱氧核糖核苷酸最后转移酶（TdT）的作用下 ，，，，，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3'-最后 ，，，，，从而可举行凋亡细胞的检测 ，，，，，这类要领称为脱氧核糖核苷酸最后转移酶介导的缺口最后标记法（terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling,TUNEL）。。。。。。由于正常的或正在增殖的细胞险些没有DNA的断裂 ，，，，，因而没有3'-OH形成 ，，，，，很少能够被染色。。。。。。TUNEL现实上是分子生物学与形态学相连系的研究要领 ，，，，，对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体举行原位染色 ，，，，，能准确地反应细胞凋亡典范的生物化学和形态特征 ，，，，，可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、作育的细胞和从组织中疏散的细胞的细胞形态测定 ，，，，，并可检测出少少量的凋亡细胞 ，，，，，因而在细胞凋亡的研究中被普遍接纳。。。。。。
六、Caspase-3活性的检测
Caspase家族在介导细胞凋亡的历程中起着很是主要的作用 ，，，，，其中caspase-3为要害的执行分子 ，，，，，它在凋亡信号传导的许多途径中施展功效。。。。。。Caspase-3正常以酶原（32KD）的形式保存于胞浆中 ，，，，，在凋亡的早期阶段 ，，，，，它被激活 ，，，，，活化的Caspase-3由两个大亚基（17KD）和两个小亚基（12KD）组成 ，，，，，裂解响应的胞浆胞核底物 ，，，，，最终导致细胞凋亡。。。。。。但在细胞凋亡的晚期和殒命细胞 ，，，，，caspase-3的活性显着下降。。。。。。
1、Western blot 剖析Procaspase-3的活化 ，，，，，以及活化的Caspase-3及对底物多聚（ADP-核糖）聚合酶[poly（ADP-ribose）polymerase ，，，，，PARP]等的裂解。。。。。。
要领：
网络细胞→PBS洗涤→抽提细胞裂解液→卵白定量→SDS-PAGE电泳→硝酸纤维素膜或PVDF膜转移→5%脱脂奶粉关闭 ，，，，，室温1.5~2h或4°C住宿→Caspase-3多抗或单抗室温反应1~2h或4°C住宿→TBS-T（含0.05% Tween 20的TBS）洗3次 ，，，，，5~10min/次→HRP-标记的羊抗鼠IgG或AP标记的羊抗鼠IgG室温反应1~2h→ TBS-T洗3次 ，，，，， 5~10min/次?→ECL显影或NBT/BCIP显色。。。。。。
效果：
2、荧光分光光度计剖析
原理：活化的Caspase-3能够特异切割D1E2V3D4-X底物 ，，，，，水解D4-X肽键。。。。。。凭证这一特点 ，，，，，设计出荧光物质偶联的短肽Ac-DEVD-AMC。。。。。。在共价偶联时 ，，，，，AMC不可被引发荧光 ，，，，，短肽被水解后释放出AMC ，，，，，自由的AMC才华被引发发射荧光。。。。。。凭证释放的AMC荧光强度的巨细 ，，，，，可以测定caspase-3的活性 ，，，，，从而反应Caspase-3被活化的水平。。。。。。
要领：收获细胞正；；；；；；虻蛲鱿赴 ，，，，，PBS洗涤 ，，，，，制备细胞裂解液加Ac-DEVD-AMC（caspase-3四肽荧光底物）?37°C反应1h ，，，，，荧光分光光度计（Polarstar）剖析荧光强度（引发光波长380nm ，，，，，发射光波长为430-460nm）。。。。。。
效果：
3、流式细胞术剖析
要领：收获细胞正；；；；；；虻蛲鱿赴?PBS洗涤 ，，，，，加Ac-DEVD-AMC 37°C反应1h UV流式细胞计剖析caspase-3阳性细胞数清静均荧光强度。。。。。。
效果：
七、凋亡相关卵白TFAR19卵白的表达和细胞定位剖析
TFAR19（PDCD5）是由本研究室在国际上首先报导的一个拥有自己知识产权的人类新基因 ，，，，，前期的功效研究批注 ，，，，，它是增进细胞凋亡的增强剂。。。。。。使用荧光素（FITC）标记的TFAR19单克隆抗体为探针 ，，，，，对细胞凋亡历程中TFAR19卵白的表达水平及定位研究发明 ，，，，，凋亡早期TFAR19表达水平增高并泛起快速核转位征象 ，，，，，陪同着细胞核形态学的转变 ，，，，，一连较长时间 ，，，，，在凋亡小体中仍然可见。。。。。。同时我们发明 ，，，，，凋亡早期TFAR19卵白的核转位早于磷脂酰丝氨酸（PS）外翻和细胞核DNA的片断化 ，，，，，提醒TFAR19卵白的核转位是细胞凋亡更早期爆发的事务之一。。。。。。进一步的研究证实 ，，，，，凋亡早期TFAR19的核转位具有普遍意义 ，，，，，差别细胞凋亡早期均泛起TFAR19高表达和核转位。。。。。。这为研究细胞凋亡早期所爆发的事务 ，，，，，提供了一种新的手艺和指标。。。。。。
（一）TFAR19卵白的细胞定位剖析
质料试剂：
FITC标记的单克隆抗体 ，，，，，pH7.4 、0.15Mol/L PBS ，，，，，3%的多聚甲醛 ，，，，，PBS-T（pH7.4 、0.15Mol/L PBS 含0.2% Tween 20） ，，，，，胎牛血清 ，，，，，荧光细胞洗液：pH7.4 、0.15Mol/L PBS含2%胎牛血清及0.1%NaN3 。。。。。。FACS管 ，，，，，Tip头 ，，，，，移液器。。。。。。
仪器：低温水平离心机, 37°C水浴箱 ，，，，，荧鲜明微镜 ，，，，，共聚焦激光扫描显微镜 ，，，，，流式细胞计
要领：
1:悬浮细胞的染色：
（1）收获正常和诱导凋亡的细胞（0.5~1′106） ，，，，，PBS洗2次 ，，，，，1000rpm′10min。。。。。。
（2）3%多聚甲醛冰浴10min ，，，，，PBS洗2次 ，，，，，1000rpm′10min。。。。。。
（3）加入PBS-T溶液 ，，，，，37°C孵育15min ，，，，，PBS洗2次 ，，，，，1000rpm′10min。。。。。。
（4）加入200ml胎牛血清 ，，，，，室温反应30min。。。。。。
（5）加入5ml FITC标记的TFAR19单抗（终浓度为1：40） ，，，，，4°C反应30min
（6）荧光细胞洗液洗2次 ，，，，，1000rpm 10min。。。。。。
效果视察：将细胞沉淀滴片 ，，，，，荧鲜明微镜及共聚焦激鲜明微镜下视察TFAR19在细胞中的定位。。。。。。同时用流式细胞计定量检测TFAR19卵白的平均荧光强度。。。。。。
2：贴壁细胞的原位染色
（1） 贴壁生长的对数期细胞铺在24孔或6孔板中（内有清洁盖玻片） ，，，，，让其爬片生长 ，，，，，待长到
50%~80%满时 ，，，，，凋亡诱导剂处置惩罚细胞。。。。。。
（2） 将差别时间点处置惩罚的细胞举行免疫荧光染色 ，，，，，染色办法同上。。。。。。
（3） 将染色的爬片细胞放于一张滴有少量甘油（5ml）的载玻片上 ，，，，，荧鲜明微镜或共聚焦激光扫描显微镜视察TFAR19在细胞中的定位。。。。。。
效果视察
3：临床病理切片的染色、检测。。。。。。
4：原代细胞的作育、检测。。。。。。
5：剖析TFAR19卵白在人体内各组织器官的漫衍及定位
（二）TFAR19卵白的表达与临床疾病
1． ELISA法检测正凡人和疾病状态下 ，，，，，以及疾病的差别时期 ，，，，，血清中TFAR19卵白水平及其TFAR19自身抗体水平。。。。。。
质料和试剂：
1. 包被Buffer: pH9.6, 0.05Mol/L碳酸盐Buffer
2. 洗涤液： pH7.4, 0.15Mol/L PBS 含0.05% Tween 20
3. 关闭液： 3%BSA（用洗涤液配制）
4. 酶标抗体的稀释：用关闭液稀释
5. OPD底物Buffer：Na2HPO4.12H2O 1.84g
柠檬酸 0.51g
DDW 100ml
6. 显色液（现配现用）：底物Buffer 10ml
OPD 2mg
30% H2O2 2ml
7. 终止液 2Mol/L H2SO48. 重组人TFAR19, HRP标记的羊抗人IgG9. ELISA板, Tip, 移液器 ，，，，，ELISA Reader（OD490nm） ，，，，，洗板机
操作办法
1. 用包被Buffer稀释的重组人TFAR19（1mg/ml）包被ELISA板, 100ml/well, 37°C孵育2h或4°C住宿（一样平常24h以上）。。。。。。
2. 洗涤Buffer洗板三次 ，，，，，加入关闭液 ，，，，，200 ml/well ，，，，， 37°C孵育2h或4°C
住宿。。。。。。
3. 洗涤Buffer洗板三次 ，，，，，加入差别稀释度的病人血清（3个重复孔）100ml/well ，，，，，37°C孵育1h。。。。。。设包被Buffer、洗涤Buffer 、关闭液为阴性比照。。。。。。
4. 洗涤Buffer洗板三次 ，，，，，加入1：2500稀释的HRP标记的抗人IgG, 100ml/well ，，，，，37°C孵育1h。。。。。。
5. 洗涤Buffer洗板三次 ，，，，，加入显色液 ，，，，，100 ml/well ，，，，，避光反应10~15min。。。。。。
6. 加入H2SO4终止反应 ，，，，，50 ml/well。。。。。。
7. ELISA Reader 读取OD490 光密度值 ，，，，，剖析和较量病人血清和正常血 清中TFAR19自身抗体的表达水平。。。。。。
2． Western blot 剖析原发性肿瘤细胞和正常细胞的TFAR19卵白的表达水平。。。。。。
