生物学功效学筛选评价之酶学筛选评价篇

在绝大大都药物作用靶点中，，，，，酶类靶点占有主要职位。。本文以酶催化反应的基本化学原理为起点，，，，，系统概述并叙述酶学研究中的几个焦点看法——Km、kcat 和 Ki 及其测定要领；；；；；；进一步剖析迅速酶学筛选要领开发的要害办法；；；；；；并综述差别类型酶抑制剂的作用机制，，，，，以及在实验检测历程中种种抑制剂的 IC?? 与 Ki 之间的关系。。

酶是生命体内化学反应的生物催化剂，，，，，能够在心理温度和常压条件下显著加速化学反应速率。。险些所有细胞生命活动历程均依赖酶的加入以提高反应效率。。特定酶活性或表达水平的异常（增强或缺失）均可能导致心理功效杂乱并引发疾病。。因此，，，，，在药物研发历程中，，，，，酶不但是主要的作用靶点，，，，，也是极具开发潜力和临床价值的靶点。。

近年来，，，，，多种以酶为靶点的药物取得了显著的临床疗效。。例如，，，，，吉祥德公司在中国上市的慢性丙型肝炎治疗药物索华迪（索磷布韦），，，，，其靶点为 NS5B RNA 聚合酶，，，，，对 HCV 1、2、3 和 6 型具有显著抗病毒活性，，，，，治愈率可达 92%–100%；；；；；；又如晚期结直肠癌的一线治疗药物伊立替康，，，，，其代谢活性产品 SN-38 是 DNA 拓扑异构酶Ⅰ抑制剂，，，，，通过稳固拓扑异构酶Ⅰ-DNA 复合物，，，，，引起 DNA 单链断裂，，，，，从而阻断 DNA 复制并抑制 RNA 合成，，，，，体现为细胞周期 S 期特异性毒性。。

别的，，，，，首款获得 FDA 批准的双药 HIV 治疗计划 Juluca 中，，，，，Dolutegravir 为 HIV-1 整合酶链转移抑制剂（INSTI），，，，，而 Rilpivirine 则是一种 非核苷类逆转录酶抑制剂（NNRTI），，，，，两者协同作用显著提高了抗病毒疗效。。

基于上述配景，，，，，怎样建设一种轻盈、高通量且可靠的酶抑制剂筛选要领，，，，，成为本文重点探讨的问题。。为此，，，，，本文将首先回首酶催化反应的基来源理，，，，，并在此基础上睁开对相关酶学参数及筛选要领的系统讨论。。

绝大大都酶学反应可用如下的简化模子举行形貌：

E 代表酶（enzyme），，，，，S 代表底物（substrate），，，，，P 代表反应产品（product）。。ES 为酶与底物在催化反应最先前形成的中心复合物，，，，，即酶–底物复合物。。E和S形成ES复合物的反应是可逆反应的历程，，，，，k1是E和S形成ES复合物的连系速率常数，，，，，相当于配体受体结适时的Kon或者Ka；；；；；； k-1是ES解离形成E和S的解离速率常数，，，，，相当于配体受体结适时的Koff或者Kd（关于以上看法可参考笔者前期的文章--生物功效学筛选评价手艺之亲和力评价篇）；；；；；；ES解离形成E和P的历程在反应初期一样平常以为是不可逆的历程，，，，，反应产品E会被反应系统中的过量的S捕获。。k2是ES形成E和P的速率常数，，，，，也被称之为Kcat,相当于配体受体结适时的Kon或者Ka酶催化效率：

酶相关于其底物的催化效率通常用 kcat/Km 来体现。。 一样平常而言，，，，，Km 值越小、kcat 值越大，，，，，催化效率越高。。Km（米氏常数）值的化学实质是E和S可逆反应历程中的解离平衡常数KD,反应的是E和S亲和力的强弱，，，，，Km值越小亲和力越强，，，，，效率越高。。Kcat值是ES解离形成E和P的速率常数。。Km值和Kcat值测定

米氏方程形貌了在稳态反应条件下酶催化反应中初始反应速率V和底物浓度 [S]的相关关系：

当V即是1/2的 Vmax时，，，，，底物浓度 [S]为Km值。。

在现实的检测历程主要包括以下几个办法：

1. 少量牢靠浓度的酶（nM或者pM级别），，，，，梯度浓度稀释的底物（底物浓度相关于酶浓度由远远过量，，，，，mM到μM）举行分组，，，，，酶催化反应；；；；；；

2. 每个分组对酶催化反应的产品举行动力学检测（酶标仪举行荧光，，，，，吸光度检测或者HPLC检测），，，，，选取各分组信号时间的线性反应区域举行V盘算；；；；；；

3. 选取梯度浓度稀释的底物动力学检测的线性区域的斜率作为初始反应速率V举行数据米氏方程拟合，，，，，拟合图形的平台期为Vmax, 1/2的Vmax时V对应的底物浓度值是Km值。。处置惩罚效果示意图如下：

4. 当酶催化反应抵达最大速率时，，，，，S远远大于E，，，，，以是所有的E均被S捕获，，，，，E和S的逆反应速率可忽略不计，，，，，[ES]=[E]

Vmax=[ES]*Kcat=[E] *Kcat,以是Kcat= Vmax/[E]

以上是Km和Kcat的测定和盘算历程，，，，，值得注重的是在现实的实验历程中需要注重以下几点：

1.必需是动力学读数，，，，，选取初始反应的线性段的斜率作为初始反应的速率。。终点法读数的效果许多时间并不可靠，，，，，应为酶催化反应随着时间的举行底物的消耗，，，，，反应速率会从匀速到非均速转变，，，，，若是接纳终点法可能获得不真实的初始速率，，，，，如下图：

2. 必需确认仪器的检测线性，，，，，当酶催化反应，，，，，产品的量过多时，，，，，凌驾仪器检测的线性区域时，，，，，检测的产品的量禁绝，，，，，影响到后续参数的盘算，，，，，如下图：

酶学药物筛选模子的建设

酶学筛选要领的几个焦点参数包括酶，，，，，反应情形，，，，，底物和抑制物。。一样平常来讲反应情形需要查阅文献举行调研，，，，，确定PH值，，，，，离子强度，，，，，洗涤剂等对酶活的影响，，，，，底物可以凭证酶催化原理选择自然底物，，，，，也可以选择合成底物（底物的选择和后续配套的检测要领细密相关）。。一个酶学要领的开发可能涉及到以下一些因素：

底物的选择和配套的检测方法，，，，，如下图某卵白水解酶，，，，，其识别的位点是氨基酸线性表位，，，，，可以人工合成多肽，，，，，在其N端和C端划分加入荧光基团和淬灭基团，，，，，正常状态下或者酶活抑制状态，，，，，该多肽在酶标仪340nm引发时，，，，，其发射光会被淬灭基团吸收，，，，，在405nm无信号爆发；；；；；；酶催化反应会将该多肽剪切，，，，，当酶标仪340nm引发时，，，，，405nm有信号爆发。。 

又如某病毒逆转录酶，，，，，合成RNA模板和对应引物，，，，，在其引物上举行生物素标记，，，，，其中碱基上举行Ru标记，，，，，随着酶催化的逆转录反应的举行，，，，，引物上一直有Ru标记碱基上去形成核苷酸序列，，，，，通过亲和素的板子捕获引物，，，，，检测Ru信号值来评判酶的催化和抑制的活性。。

酶，，，，，底物浓度的选择和反应时间的选择

当酶对应的底物确定以后，，，，，选取少量的酶浓度（pM或者nM）对底物举行Km测定，，，，，选取底物的Km浓度作为筛选的反应浓度，，，，，选取该浓度下线性的反应时间内的某个时间点作为反应终止或者检测的时间。。酶和梯度稀释的化合物举行预孵育后，，，，，加入Km浓度的底物，，，，，反应一段时间后举行检测，，，，，这个就是一样平常酶学筛选模子。。

酶抑制剂机理研究

关于靶点酶的抑制剂，，，，，主要可以归纳为三类（Competitive竞争性, Noncompetitive非竞争性, Uncompetitive不竞争性）

Competitive竞争性抑制剂只和自由的酶连系，，，，，通常情形下和底物配合竞争连系位点（活性中心），，，，，虽然也有竞争性抑制剂和底物互斥的情形泛起，，，，，两其中只有一个能够和自由的酶连系。。在竞争性抑制剂保存的情形下，，，，，酶相关于底物的Km和Vmax测准时，，，，，测得得表观Km值增添，，，，，Vmax值稳固，，，，，如下图所示，，，，，几种竞争性抑制剂的图示： 

Noncompetitive非竞争性抑制剂

非竞争性抑制剂可以和自由的酶连系，，，，，也可以和酶-底物复合物连系，，，，，抑制剂连系的位点和活性中心位点不在相同的表位，，，，，最终也会导致酶催化活性的损失。。在非竞争性抑制剂保存的情形下，，，，，酶相关于底物的Km和Vmax测准时，，，，，测得得表观Km值稳固，，，，，Vmax值降低，，，，，如下图所示：

Uncompetitive不竞争性抑制剂

不竞争性抑制剂只和酶-底物复合物连系，，，，，形成失活的抑制剂-酶-底物复合物。。酶相关于底物的Km和Vmax测准时，，，，，测得得表观Km值降低，，，，，Vmax值降低。。如下图所示：

差别类型抑制剂Ki和IC50之间的关联

Ki形貌的是抑制剂和酶的连系强弱，，，，，是抑制剂和酶的解离平衡常数，，，，，是个状态函数，，，，，不会受到反应系统中底物浓度的影响，，，，，差别实验获得的Ki值具有可比性；；；；；；而IC50则是在特定酶学检测要领中酶活抑制一半时抑制剂的浓度，，，，，凭证差别类型的抑制剂，，，，，底物浓度可能对IC50爆发影响，，，，，差别实验获得的IC50值不具可比性。。凭证差别类型的抑制剂，，，，，在理想条件下（酶浓度远远小于底物浓度举行反应），，，，，Ki和IC50的关系如下：

差别抑制剂类型IC50和反应系统中加入的底物浓度的关系示意图如下： 

展望：

绝大大都生命活动的调控均是有酶的加入，，，，，对酶的选择性抑制可以调控细胞的增殖、分解、凋亡以及免疫调理等许多主要的生物学历程，，，，，如JAK抑制剂，，，，，IDO抑制剂等在临床研究或者市场上证实晰其价值或者潜在的价值。。相识酶学反应的化学原理，，，，，搭建合适的酶学筛选模子；；；；；；表征酶抑制剂的差别抑制机理，，，，，也有助于细微区分差别抑制机理药物可能起到的差别性的临床获益。。

使用酶催化反应举行体外的功效学检测也是常用的工具，，，，，如ELISA中HRP酶的催化显色，，，，，细胞活性检测时琥珀酸脱氢酶催化的CCK8检测，，，，，报告基因检测历程中luciferase酶催化的化学发光等，，，，，相识其化学原理和动力学反应历程有助于功效学要领学开发，，，，，优化检测要领的条件。。

酶催化反应是明确体外生物功效学评价系统承上启下的一环，，，，，此反应历程形貌了是从Binding(affinity)转换到function（potency）的历程，，，，，且在理想条件下此历程是线性转达的，，，，，即产品天生量是ES的量和Kcat的乘积，，，，，Vp=[ES]*Kcat。。与之相对的，，，，，卵白相互作用历程中，，，，，只有Binding(affinity)，，，，，大部分受体介导的细胞学效应既有Binding(affinity)，，，，，也有function（potency），，，，，可是由Binding(affinity)到function（potency）之间的转达往往是非线性的，，，，，每种细胞由于其细胞内情形卵白的表达差别性会导致由胞外连系引起的刺激非均一放大形成差别性效用。。下一篇笔者将会对更为重大的细胞学相关测定要领举行讨论。。

参考资料

《Guidance for Assay Development & HTS》

SECTION V: ENZYMATIC ASSAYS

SECTION XII: MECHANISM OF ACTION ASSAYSFOR ENZYMES